１．１仪器与试剂
ＡＬＬＩＡＮＣＥ２６９５型高效液相色谱仪，配Ａｌｌｉ
ａｎｃｅｅ２６９５型四元梯度输液系统、在线微流真空脱
气机、自动进样器、柱温箱、２９９８型二极管阵列检测
器（ＰＤＡ）和Ｅｍｐｏｗｅｒ２型色谱工作站；ＸＳ２０４型
电子天平；ＫＱ１００Ｖ型超声波清洗仪；Ｓｉｇｍａ３ｋ３０
型台式高速冷冻离心机；ＰＨＳ３Ｃ型ｐＨ计；ＭｉｌｌｉＱ
超纯水发生器。
磷酸氢二钾溶液：０．１ｍｏｌ·Ｌ－１，称取磷酸氢二
钾２２．８２２０ｇ，用水溶解并定容至１Ｌ容量瓶中。
用磷酸调节ｐＨ至２．５，过０．４５μｍ滤膜后作为流
动相；用磷酸调节ｐＨ至８．０，作为样品提取液。
铬标 准 储 备 溶 液：０．１０００ｇ·Ｌ－１，称 取 在
（１０２±２）°C下干燥（１６±２）ｈ的重铬酸钾标准物质
０．２８２９ｇ，用水溶解并定容至１Ｌ容量瓶中。
铬标准溶液：１．００ｍｇ·Ｌ－１，移取铬标准储备
溶液１．００ｍＬ，用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶液定
容至１００ｍＬ容量瓶中。
二苯卡巴肼溶液：１０ｇ·Ｌ－１，称取１，５二苯卡
巴肼１．０ｇ，溶解于１００ｍＬ丙酮中，加一滴乙酸，呈
酸性，备用。甲醇、丙酮为色谱纯；１，５二苯卡巴肼、磷酸氢
二钾、磷酸、聚乙二醇２０００、硫酸钠均为分析纯；试
验用水为超纯水（电阻率为１８．２ ＭΩ·ｃｍ）。所有
溶液在使用前都经过０．４５μｍ滤膜过滤。
１．２色谱条件
ＸｔｅｒｒａＯＤＳＣ１８色 谱 柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，
５μｍ），柱温２５ °C；流动相为ｐＨ２．５的０．１ｍｏｌ·
Ｌ－１磷酸氢二钾溶液甲醇（５７＋４３）混合溶液，流量
１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；进样量２０μＬ；检测波长５４０ｎｍ。
１．３试验方法
怀药样品采自毛皮加工厂周边地区种植品种。
样品经风干、粉碎后过０．３ｍｍ孔径筛备用。
称取怀药试样１．００００ｇ于５０ｍＬ锥形瓶中，
加入ｐＨ ８．０的０．１ ｍｏｌ·Ｌ－１磷 酸 氢 二 钾 溶 液
２０ｍＬ，超声提取２０ｍｉｎ，离心；提取液移至５０ｍＬ
离心管中，再用磷酸氢二钾溶液１０ ｍＬ重复提取
２次，合并３次提取液，并用磷酸氢二钾溶液稀释至
刻度，以５０００ｒ·ｍｉｎ－１转速离心５ｍｉｎ，备用。
移取上述提取液２．００ｍＬ于２５ｍＬ离心管中，
加入磷酸（７＋３）溶液０．５ｍＬ，然后加入１０ｇ·Ｌ－１
的１，５二苯卡巴肼溶液０．５ｍＬ，３００ｇ·Ｌ－１聚乙二
醇溶液５ｍＬ，硫酸钠１．５ｇ后，用水稀释至刻度，振
荡１ｍｉｎ，超声萃取２０ｍｉｎ，静止５ｍｉｎ。移取聚乙
二醇层过０．４５μｍ滤膜，按仪器工作条件进行测定。
２结果与讨论
２．１提取剂及提取时间的选择
样品提取应在ｐＨ７．５～８．０的介质中进行，因
为在碱性环境下，三价铬容易被氧化为六价铬；在酸
性环境下，六价铬呈强氧化性，容易被还原为三价
铬［３］
。试验考察了不同浓度的ｐＨ８．０的氯化钾、
磷酸氢二钾和碳酸钠溶液分别作为提取剂进行超声
提取的效果，结果见图１。
提取效果最佳。试验选择０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二
钾溶液为提取剂。
同时试验对提取时间进行了优化，结果表明：随
着提取时间的增加，提取效果提高；当提取时间达到
２０ｍｉｎ时，随提取时间的延长，提取效果无明显的
变化。试验选择提取时间为２０ｍｉｎ。
２．２流动相的选择
２．２．１流动相组成
试验选择甲醇和０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶
液作为流动相进行分离和测定。考察了流动相组成
比分别为８０∶２０，６０∶４０，５０∶５０，４３∶５７，４０∶６０
和２０∶８０时的效果。结果表明：改变甲醇和磷酸氢
二钾溶液的比例，可得到不同的分离效果；流动相中
甲醇比例的变化会使组分在色谱柱内的保留时间发
生改变，甲醇比例增大可以缩短被测组分的保留时
间，但被测组分可能分离不完全，色谱峰重叠；甲醇
比例减小，分离效果变好，但被测组分的保留时间变
长，且峰形变差，影响分离检测的准确度和精密度。
综合考虑分离效果、分析时间等因素，试验选择流动
相为０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶液甲醇（５７＋４３）
混合溶液。２．２．２磷酸氢二钾溶液的浓度
增加流动相组成中磷酸氢二钾的浓度可选择性
地降低分离组分的保留值，但高浓度的盐溶液在与
有机相溶剂混合时容易造成瞬间的过饱和而析出晶
体，从而造成色谱系统堵塞。试验在相同流动相配
比 下，考 察 了 浓 度 分 别 为０．０５，０．１，０．２５，
０．５ｍｏｌ·Ｌ－１的磷酸氢二钾溶液对分离度的影响，
结果表明：使用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶液时，
分离度最高。试验选择磷酸氢二钾溶液的浓度为
０．１ｍｏｌ·Ｌ－１。
２．２．３磷酸氢二钾溶液的酸度
调节磷酸氢二钾溶液的ｐＨ可以调整分离组分
的保留时间，改善分离组分的峰形，从而影响其在色
谱柱上的保留行为。试验保持磷酸氢二钾溶液的浓
度为０．１ｍｏｌ·Ｌ－１，在相同条件下，考察了磷酸氢
二钾溶液的ｐＨ分别为２．０，２．５，３．０，３．５，４．０对分
离度的影响，结果表明：随ｐＨ增大，分离度降低。
综合考虑溶液酸度对色谱柱的影响，试验选择磷酸
氢二钾铵溶液的ｐＨ为２．５。
２．３标准曲线与检出限
分别 移 取１．００ ｍｇ·Ｌ－１铬 标 准 溶 液０．０５０．１０，０．１５，０．２０，０．２５，０．５０，１．００，１．５０，２．００，
２．５０，５．００，１０．００ｍＬ于２５ｍＬ容量瓶中，配制成
质量浓度为２．０，４．０，６．０，８．０，１０．０，２０．０，４０．０，
６０．０，８０．０，１００，２００，４００μｇ·Ｌ－１的铬标准溶液，按
试验方法进行处理和色谱分析。以铬的质量浓度为
横坐标，对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，结果
表明：六价铬的质量浓度在４．０～４００μｇ·Ｌ－１范围
内与 峰 面 积 呈 线 性 关 系，线 性 回 归 方 程 为
狔＝
５６９．０
狓＋６４５．２，相关系数为０．９９９７，以３倍信噪
比计算检出限（３Ｓ／Ｎ）为４０ｎｇ·Ｌ－１。２．４精密度和回收试验
在怀药样品中添加高、中、低等３个浓度水平的
铬标准溶液，每个添加水平重复测定５次，计算加标
回收率和精密度，结果见表１
按试验方法对１６种怀药样品（每种４份）处理
后进行测定，发现一个阳性样品，其六价铬的测定值
为０．３５ｍｇ·ｋｇ－１，其色谱图见图２
中的六价铬，具有灵敏度高和精密度高的优点，可在
测定中草药中六价铬的分析中发挥参考作用。