高效液相色谱法快速测定怀药中的六价铬
１ 试验部分
１．１ 仪器与试剂
ＡＬＬＩＡＮＣＥ２６９５型高效液相色谱仪，配 Ａｌｌｉ
ａｎｃｅｅ２６９５型四元梯度输液系统、在线微流真空脱
气机、自动进样器、柱温箱、２９９８型二极管阵列检测
器（ＰＤＡ）和 Ｅｍｐｏｗｅｒ２型色谱工作站；ＸＳ２０４型
电子天平；ＫＱ１００Ｖ 型超声波清洗仪；Ｓｉｇｍａ３ｋ３０
型台式高速冷冻离心机；ＰＨＳ３Ｃ型ｐＨ 计；ＭｉｌｌｉＱ
超纯水发生器。
磷酸氢二钾溶液：０．１ｍｏｌ·Ｌ－１，称取磷酸氢二
钾２２．８２２０ｇ，用水溶解并定容至 １Ｌ 容量瓶中。
用磷酸调节ｐＨ 至２．５，过０．４５μｍ 滤膜后作为流
动相；用磷酸调节ｐＨ 至８．０，作为样品提取液。
铬标 准 储 备 溶 液：０．１０００ｇ·Ｌ－１，称 取 在
（１０２±２）°C下干燥（１６±２）ｈ的重铬酸钾标准物质
０．２８２９ｇ，用水溶解并定容至１Ｌ容量瓶中。
铬标准溶液：１．００ｍｇ·Ｌ－１，移取铬标准储备
溶液１．００ｍＬ，用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶液定
容至１００ｍＬ容量瓶中。
二苯卡巴肼溶液：１０ｇ·Ｌ－１，称取１，５二苯卡
巴肼１．０ｇ，溶解于１００ｍＬ丙酮中，加一滴乙酸，呈
酸性，备用。甲醇、丙酮为色谱纯；１，５二苯卡巴肼、磷酸氢
二钾、磷酸、聚乙二醇２０００、硫酸钠均为分析纯；试
验用水为超纯水（电阻率为１８．２ ＭΩ·ｃｍ）。所有
溶液在使用前都经过０．４５μｍ 滤膜过滤。
１．２ 色谱条件
ＸｔｅｒｒａＯＤＳＣ１８ 色 谱 柱 （２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，
５μｍ），柱温２５ °C；流动相为ｐＨ２．５的０．１ｍｏｌ·
Ｌ－１磷酸氢二钾溶液甲醇（５７＋４３）混合溶液，流量
１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；进样量２０μＬ；检测波长５４０ｎｍ。
１．３ 试验方法
怀药样品采自毛皮加工厂周边地区种植品种。
样品经风干、粉碎后过０．３ｍｍ 孔径筛备用。
称取怀药试样１．００００ｇ于５０ｍＬ 锥形瓶中，
加入 ｐＨ ８．０ 的 ０．１ ｍｏｌ·Ｌ－１ 磷 酸 氢 二 钾 溶 液
２０ｍＬ，超声提取２０ｍｉｎ，离心；提取液移至５０ｍＬ
离心管中，再用磷酸氢二钾溶液 １０ ｍＬ 重复提取
２次，合并３次提取液，并用磷酸氢二钾溶液稀释至
刻度，以５０００ｒ·ｍｉｎ－１转速离心５ｍｉｎ，备用。
移取上述提取液２．００ｍＬ于２５ｍＬ离心管中，
加入磷酸（７＋３）溶液０．５ｍＬ，然后加入１０ｇ·Ｌ－１
的１，５二苯卡巴肼溶液０．５ｍＬ，３００ｇ·Ｌ－１聚乙二
醇溶液５ｍＬ，硫酸钠１．５ｇ后，用水稀释至刻度，振
荡１ｍｉｎ，超声萃取２０ｍｉｎ，静止５ｍｉｎ。移取聚乙
二醇层过０．４５μｍ滤膜，按仪器工作条件进行测定。
２ 结果与讨论
２．１ 提取剂及提取时间的选择
样品提取应在ｐＨ７．５～８．０的介质中进行，因
为在碱性环境下，三价铬容易被氧化为六价铬；在酸
性环境下，六价铬呈强氧化性，容易被还原为三价
铬［３］
。试验考察了不同浓度的 ｐＨ８．０的氯化钾、
磷酸氢二钾和碳酸钠溶液分别作为提取剂进行超声
提取的效果，结果见图１。
提取效果最佳。试验选择０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二
钾溶液为提取剂。
同时试验对提取时间进行了优化，结果表明：随
着提取时间的增加，提取效果提高；当提取时间达到
２０ｍｉｎ时，随提取时间的延长，提取效果无明显的
变化。试验选择提取时间为２０ｍｉｎ。
２．２ 流动相的选择
２．２．１ 流动相组成
试验选择甲醇和０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶
液作为流动相进行分离和测定。考察了流动相组成
比分别为８０∶２０，６０∶４０，５０∶５０，４３∶５７，４０∶６０
和２０∶８０时的效果。结果表明：改变甲醇和磷酸氢
二钾溶液的比例，可得到不同的分离效果；流动相中
甲醇比例的变化会使组分在色谱柱内的保留时间发
生改变，甲醇比例增大可以缩短被测组分的保留时
间，但被测组分可能分离不完全，色谱峰重叠；甲醇
比例减小，分离效果变好，但被测组分的保留时间变
长，且峰形变差，影响分离检测的准确度和精密度。
综合考虑分离效果、分析时间等因素，试验选择流动
相为０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶液甲醇（５７＋４３）
混合溶液。２．２．２ 磷酸氢二钾溶液的浓度
增加流动相组成中磷酸氢二钾的浓度可选择性
地降低分离组分的保留值，但高浓度的盐溶液在与
有机相溶剂混合时容易造成瞬间的过饱和而析出晶
体，从而造成色谱系统堵塞。试验在相同流动相配
比 下，考 察 了 浓 度 分 别 为 ０．０５，０．１，０．２５，
０．５ｍｏｌ·Ｌ－１的磷酸氢二钾溶液对分离度的影响，
结果表明：使用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶液时，
分离度最高。试验选择磷酸氢二钾溶液的浓度为
０．１ｍｏｌ·Ｌ－１。
２．２．３ 磷酸氢二钾溶液的酸度
调节磷酸氢二钾溶液的ｐＨ 可以调整分离组分
的保留时间，改善分离组分的峰形，从而影响其在色
谱柱上的保留行为。试验保持磷酸氢二钾溶液的浓
度为０．１ｍｏｌ·Ｌ－１，在相同条件下，考察了磷酸氢
二钾溶液的ｐＨ 分别为２．０，２．５，３．０，３．５，４．０对分
离度的影响，结果表明：随 ｐＨ 增大，分离度降低。
综合考虑溶液酸度对色谱柱的影响，试验选择磷酸
氢二钾铵溶液的ｐＨ 为２．５。
２．３ 标准曲线与检出限
分别 移 取 １．００ ｍｇ·Ｌ－１ 铬 标 准 溶 液 ０．０５０．１０，０．１５，０．２０，０．２５，０．５０，１．００，１．５０，２．００，
２．５０，５．００，１０．００ｍＬ 于２５ｍＬ 容量瓶中，配制成
质量浓度为２．０，４．０，６．０，８．０，１０．０，２０．０，４０．０，
６０．０，８０．０，１００，２００，４００μｇ·Ｌ－１的铬标准溶液，按
试验方法进行处理和色谱分析。以铬的质量浓度为
横坐标，对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，结果
表明：六价铬的质量浓度在４．０～４００μｇ·Ｌ－１范围
内与 峰 面 积 呈 线 性 关 系，线 性 回 归 方 程 为
狔＝
５６９．０
狓＋６４５．２，相关系数为０．９９９７，以３倍信噪
比计算检出限（３Ｓ／Ｎ）为４０ｎｇ·Ｌ－１。２．４ 精密度和回收试验
在怀药样品中添加高、中、低等３个浓度水平的
铬标准溶液，每个添加水平重复测定５次，计算加标
回收率和精密度，结果见表１
按试验方法对１６种怀药样品（每种４份）处理
后进行测定，发现一个阳性样品，其六价铬的测定值
为０．３５ｍｇ·ｋｇ－１，其色谱图见图２
中的六价铬，具有灵敏度高和精密度高的优点，可在
测定中草药中六价铬的分析中发挥参考作用。
１．１ 仪器与试剂
ＡＬＬＩＡＮＣＥ２６９５型高效液相色谱仪，配 Ａｌｌｉ
ａｎｃｅｅ２６９５型四元梯度输液系统、在线微流真空脱
气机、自动进样器、柱温箱、２９９８型二极管阵列检测
器（ＰＤＡ）和 Ｅｍｐｏｗｅｒ２型色谱工作站；ＸＳ２０４型
电子天平；ＫＱ１００Ｖ 型超声波清洗仪；Ｓｉｇｍａ３ｋ３０
型台式高速冷冻离心机；ＰＨＳ３Ｃ型ｐＨ 计；ＭｉｌｌｉＱ
超纯水发生器。
磷酸氢二钾溶液：０．１ｍｏｌ·Ｌ－１，称取磷酸氢二
钾２２．８２２０ｇ，用水溶解并定容至 １Ｌ 容量瓶中。
用磷酸调节ｐＨ 至２．５，过０．４５μｍ 滤膜后作为流
动相；用磷酸调节ｐＨ 至８．０，作为样品提取液。
铬标 准 储 备 溶 液：０．１０００ｇ·Ｌ－１，称 取 在
（１０２±２）°C下干燥（１６±２）ｈ的重铬酸钾标准物质
０．２８２９ｇ，用水溶解并定容至１Ｌ容量瓶中。
铬标准溶液：１．００ｍｇ·Ｌ－１，移取铬标准储备
溶液１．００ｍＬ，用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶液定
容至１００ｍＬ容量瓶中。
二苯卡巴肼溶液：１０ｇ·Ｌ－１，称取１，５二苯卡
巴肼１．０ｇ，溶解于１００ｍＬ丙酮中，加一滴乙酸，呈
酸性，备用。甲醇、丙酮为色谱纯；１，５二苯卡巴肼、磷酸氢
二钾、磷酸、聚乙二醇２０００、硫酸钠均为分析纯；试
验用水为超纯水（电阻率为１８．２ ＭΩ·ｃｍ）。所有
溶液在使用前都经过０．４５μｍ 滤膜过滤。
１．２ 色谱条件
ＸｔｅｒｒａＯＤＳＣ１８ 色 谱 柱 （２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，
５μｍ），柱温２５ °C；流动相为ｐＨ２．５的０．１ｍｏｌ·
Ｌ－１磷酸氢二钾溶液甲醇（５７＋４３）混合溶液，流量
１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；进样量２０μＬ；检测波长５４０ｎｍ。
１．３ 试验方法
怀药样品采自毛皮加工厂周边地区种植品种。
样品经风干、粉碎后过０．３ｍｍ 孔径筛备用。
称取怀药试样１．００００ｇ于５０ｍＬ 锥形瓶中，
加入 ｐＨ ８．０ 的 ０．１ ｍｏｌ·Ｌ－１ 磷 酸 氢 二 钾 溶 液
２０ｍＬ，超声提取２０ｍｉｎ，离心；提取液移至５０ｍＬ
离心管中，再用磷酸氢二钾溶液 １０ ｍＬ 重复提取
２次，合并３次提取液，并用磷酸氢二钾溶液稀释至
刻度，以５０００ｒ·ｍｉｎ－１转速离心５ｍｉｎ，备用。
移取上述提取液２．００ｍＬ于２５ｍＬ离心管中，
加入磷酸（７＋３）溶液０．５ｍＬ，然后加入１０ｇ·Ｌ－１
的１，５二苯卡巴肼溶液０．５ｍＬ，３００ｇ·Ｌ－１聚乙二
醇溶液５ｍＬ，硫酸钠１．５ｇ后，用水稀释至刻度，振
荡１ｍｉｎ，超声萃取２０ｍｉｎ，静止５ｍｉｎ。移取聚乙
二醇层过０．４５μｍ滤膜，按仪器工作条件进行测定。
２ 结果与讨论
２．１ 提取剂及提取时间的选择
样品提取应在ｐＨ７．５～８．０的介质中进行，因
为在碱性环境下，三价铬容易被氧化为六价铬；在酸
性环境下，六价铬呈强氧化性，容易被还原为三价
铬［３］
。试验考察了不同浓度的 ｐＨ８．０的氯化钾、
磷酸氢二钾和碳酸钠溶液分别作为提取剂进行超声
提取的效果，结果见图１。
提取效果最佳。试验选择０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二
钾溶液为提取剂。
同时试验对提取时间进行了优化，结果表明：随
着提取时间的增加，提取效果提高；当提取时间达到
２０ｍｉｎ时，随提取时间的延长，提取效果无明显的
变化。试验选择提取时间为２０ｍｉｎ。
２．２ 流动相的选择
２．２．１ 流动相组成
试验选择甲醇和０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶
液作为流动相进行分离和测定。考察了流动相组成
比分别为８０∶２０，６０∶４０，５０∶５０，４３∶５７，４０∶６０
和２０∶８０时的效果。结果表明：改变甲醇和磷酸氢
二钾溶液的比例，可得到不同的分离效果；流动相中
甲醇比例的变化会使组分在色谱柱内的保留时间发
生改变，甲醇比例增大可以缩短被测组分的保留时
间，但被测组分可能分离不完全，色谱峰重叠；甲醇
比例减小，分离效果变好，但被测组分的保留时间变
长，且峰形变差，影响分离检测的准确度和精密度。
综合考虑分离效果、分析时间等因素，试验选择流动
相为０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶液甲醇（５７＋４３）
混合溶液。２．２．２ 磷酸氢二钾溶液的浓度
增加流动相组成中磷酸氢二钾的浓度可选择性
地降低分离组分的保留值，但高浓度的盐溶液在与
有机相溶剂混合时容易造成瞬间的过饱和而析出晶
体，从而造成色谱系统堵塞。试验在相同流动相配
比 下，考 察 了 浓 度 分 别 为 ０．０５，０．１，０．２５，
０．５ｍｏｌ·Ｌ－１的磷酸氢二钾溶液对分离度的影响，
结果表明：使用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钾溶液时，
分离度最高。试验选择磷酸氢二钾溶液的浓度为
０．１ｍｏｌ·Ｌ－１。
２．２．３ 磷酸氢二钾溶液的酸度
调节磷酸氢二钾溶液的ｐＨ 可以调整分离组分
的保留时间，改善分离组分的峰形，从而影响其在色
谱柱上的保留行为。试验保持磷酸氢二钾溶液的浓
度为０．１ｍｏｌ·Ｌ－１，在相同条件下，考察了磷酸氢
二钾溶液的ｐＨ 分别为２．０，２．５，３．０，３．５，４．０对分
离度的影响，结果表明：随 ｐＨ 增大，分离度降低。
综合考虑溶液酸度对色谱柱的影响，试验选择磷酸
氢二钾铵溶液的ｐＨ 为２．５。
２．３ 标准曲线与检出限
分别 移 取 １．００ ｍｇ·Ｌ－１ 铬 标 准 溶 液 ０．０５０．１０，０．１５，０．２０，０．２５，０．５０，１．００，１．５０，２．００，
２．５０，５．００，１０．００ｍＬ 于２５ｍＬ 容量瓶中，配制成
质量浓度为２．０，４．０，６．０，８．０，１０．０，２０．０，４０．０，
６０．０，８０．０，１００，２００，４００μｇ·Ｌ－１的铬标准溶液，按
试验方法进行处理和色谱分析。以铬的质量浓度为
横坐标，对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，结果
表明：六价铬的质量浓度在４．０～４００μｇ·Ｌ－１范围
内与 峰 面 积 呈 线 性 关 系，线 性 回 归 方 程 为
狔＝
５６９．０
狓＋６４５．２，相关系数为０．９９９７，以３倍信噪
比计算检出限（３Ｓ／Ｎ）为４０ｎｇ·Ｌ－１。２．４ 精密度和回收试验
在怀药样品中添加高、中、低等３个浓度水平的
铬标准溶液，每个添加水平重复测定５次，计算加标
回收率和精密度，结果见表１
按试验方法对１６种怀药样品（每种４份）处理
后进行测定，发现一个阳性样品，其六价铬的测定值
为０．３５ｍｇ·ｋｇ－１，其色谱图见图２
中的六价铬，具有灵敏度高和精密度高的优点，可在
测定中草药中六价铬的分析中发挥参考作用。
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